Kit PCR în timp real pentru virusul variolei

1. ProbaColectie:Specimenul trebuie colectat în tuburi sterile în conformitate

cu specificatii tehnice standard.

2. Prepararea reactivului (Zona de preparare a reactivului)

Scoateți componentele kitului, echilibrați-le la temperatura camerei pentru utilizare în standby.

3. Prelucrarea probei (Zona de prelucrare a probelor)

3.1 Extracția acidului nucleic

Se recomandă prelevarea de probe lichide de 200μL, Control Pozitiv și Control Negativ pentru extracția acidului nucleic, conform cerințelor și procedurilor corespunzătoare truselor de extracție ADN viral.

3.2 Dizolvarea pulberii liofilizate și adăugarea șablonului

Pregătiți premixul liofilizat Monkeypox Virus în funcție de numărul de probe.O probă necesită un tub PCR care conține pulbere de premix liofilizat.Controlul negativ și controlul pozitiv trebuie tratate ca două probe.

(1) Adăugați 15μL de soluție de dizolvare în fiecare tub PCR care conține premix liofilizat, apoi adăugați 5μL probe extrase/control negativ/control pozitiv în fiecare tub PCR, respectiv.

(2) Acoperiți bine tuburile PCR, aruncați tuburile PCR cu mâna până când pulberea liofilizată este complet dizolvată și amestecată, colectați lichidul pe fundul tuburilor PCR prin centrifugare instantanee la viteză mică.

(3) Dacă utilizați un instrument comun PCR în timp real pentru detectare, apoi transferați direct tuburile PCR în zona de amplificare;dacă utilizați BTK-8 pentru detectare, atunci trebuie să efectuați următoarele operații: transferați 10 μL de lichid din tubul PCR în godeul de cip de reacție al BTK-8.Un tub PCR corespunde unui godeu de pe cip.În timpul operațiunii de pipetare, asigurați-vă că pipeta este verticală la 90 de grade.Vârfurile pipetei cu barieră de aerosoli trebuie plasate în centrul godeului cu o forță moderată și nu mai împingeți pipeta când ajunge la prima treaptă de viteză (pentru a evita bulele).După ce godeurile sunt umplute, scoateți o membrană a cipului de reacție pentru a acoperi toate godeurile și cip-ul este apoi transferat în zona de detectare a amplificarii.

4. Amplificare PCR (zonă de detectare)

4.1 Puneți tuburile PCR/cipul de reacție în rezervorul de reacție și setați numele fiecărui godeu de reacție în ordinea corespunzătoare.

4.2 Setări ale fluorescenței de detectare: (1) Virusul variolei maimuței (FAM);(2) Control intern (CY5).

4.3 Rulați următorul protocol de ciclism

Protocolul ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protocolul BTK-8:

5. Analiza rezultatelor (vă rugăm să consultați Manualul utilizatorului instrumentului)

După reacție, rezultatele vor fi salvate automat.Faceți clic pe „Analizați” pentru a analiza, iar instrumentul va interpreta automat valorile Ct ale fiecărei probe din coloana cu rezultate.Rezultatele controalelor negative și pozitive trebuie să fie conforme cu următorul „6. Controlul calității”.

6. Control de calitate

6.1 Control negativ: Fără Ct sau Ct>40 în canalul FAM, Ct≤40 în canalul CY5 cu curbă normală de amplificare.

6.2 Control pozitiv: Ct≤35 în canalul FAM cu curba normală de amplificare, Ct≤40 în canalul CY5 cu curba normală de amplificare.

6.3 Rezultatul este valabil dacă toate criteriile de mai sus sunt îndeplinite.În caz contrar, rezultatul este invalid.

Interpretarea rezultatelor

Următoarele rezultate sunt posibile:

NOTĂ: Dacă apare un rezultat nevalid, proba trebuie colectată și testată din nou.